液相色譜柱的選擇方法概述

選擇方法一：填料的種類

填料的基質(zhì)一般選擇使用多孔硅膠或聚合物等，在細(xì)孔的表面有多種經(jīng)過化學(xué)修飾的官能團(tuán)。

利用目標(biāo)成分疏水性的不同起到分離效果的反相分離模式，利用極性不同進(jìn)行分離的正相分離模式，根據(jù)分子大小的不同而分離的尺寸排阻模式，根據(jù)離子性質(zhì)的不同而達(dá)到分離的離子交換模式，又或者分離光學(xué)異構(gòu)體等，根據(jù)目的的不同，需要

選擇對(duì)應(yīng)的填料。

作為填充劑的代表十八烷基、辛基、丁基等即在硅膠的細(xì)孔表面化學(xué)鍵合的 C18（ODS）、C8 或 C4 等，碳鏈越長(zhǎng)，疏水性（保留能力）越強(qiáng)。

選擇方法二：填料孔徑

多孔硅膠為基體的填料表面具有無數(shù)的細(xì)孔，需要根據(jù)目的成分的分子量選擇對(duì)應(yīng)大小的填料孔徑。微孔徑 100Å（10nm）對(duì) 應(yīng) 5000 左右 的 分 子 量。 分 子 量 大 于 5000 的， 可 以 選 擇300Å（30nm）或以上的大孔徑柱子。目的成分能夠進(jìn)入孔的話，才能與官能團(tuán)相互作用從而起到分離的效果。對(duì)于大分子蛋白質(zhì)或聚合物等高分子，如果不是大孔徑的基體，與官能團(tuán)的相互作用就會(huì)減少。另外，分析低分子時(shí)，選擇太大的微孔，由于會(huì)擴(kuò)散故導(dǎo)致峰型可能會(huì)展寬。

選擇方法三：填料粒徑

一般 HPLC 多使用粒徑為 5μm 的球狀硅膠，近年來也逐步開始使用 2μm 以下的微粒子，粒徑越小色譜柱理論塔板數(shù)就越高，得到峰型也就越尖銳，分離越好。而且，粒徑越小，即使流速上升，理論塔板數(shù)降低很少，微粒子色譜柱越來越適合快速分析。但是，微粒子使用時(shí)，必須注意使用壓力。3μm 以下適合UHPLC快速分析，3 ～ 5μm 適合一般的 HPLC 柱分析，10μm 則作為制備 HPLC 柱使用。

選擇方法四：色譜柱尺寸 （長(zhǎng)度）

一般使用較多的色譜柱的長(zhǎng)度，通用型，制備 HPLC 柱長(zhǎng)度為150 ～ 250mm，LC/MS 為 100-150mm，超快速 HPLC（UHPLC）為 50-100mm。色譜柱長(zhǎng)度越長(zhǎng)理論塔板數(shù)也越高。只是，需要注意，色譜柱長(zhǎng)度加倍后，分析時(shí)間與使用壓力也會(huì)加倍。

對(duì)于 2μm 或者 3μm 的微粒子，分離度和理論塔板數(shù)都較好時(shí)，將色譜柱的長(zhǎng)度變短，可以縮短分析時(shí)間，進(jìn)行快速分析。

選擇方法五：色譜柱尺寸 （內(nèi)徑）

一般通用的 HPLC 柱內(nèi)徑為 4.6mm，LC/MS 內(nèi)徑多為 2.1mm，毛細(xì)管 HPLC 色譜柱為不滿 1mm，制備 HPLC 色譜柱6.0mm 以上。通用 HPLC 系列，內(nèi)徑不同得到的結(jié)果也不同。即使改變內(nèi)徑，根據(jù)色譜柱的截面積比改變相應(yīng)的流速，保留時(shí)間基本不會(huì)改變。特別是對(duì)于像 UV、RI 一樣對(duì)于濃度要求很高的檢測(cè)器而言，流速越小，其對(duì)應(yīng)的靈敏度也越高。需要注意的是，通用型 HPLC 色譜柱內(nèi)徑太小，裝置的死體積（管路內(nèi)多余的配管或者流通池容量）影響變大，峰型會(huì)變寬。并且根據(jù) HPLC 系統(tǒng)使用目的的不同（分析、制備、毛細(xì)管等）種類也不同，能夠設(shè)定的正確的流速與流速范圍，系統(tǒng)響應(yīng)等也會(huì)不同，所以根據(jù)系統(tǒng)不同選擇對(duì)應(yīng)的內(nèi)徑是十分重要的。

選擇方法六：端基封尾

端基封尾是硅膠表面有一種被稱為硅醇基的弱酸性官能團(tuán)（Si-OH）存在。作為反相分配填料等合成時(shí)，利用硅醇基對(duì)十八烷基（ODS：C18）進(jìn)行化學(xué)鍵合。然而，部分沒有鍵合殘留的硅醇基會(huì)與堿性化合物吸附，引起峰拖尾。為了防止這種現(xiàn)象，使用甲基等短鏈基團(tuán)對(duì)殘存硅醇基進(jìn)行處理，這個(gè)過程就稱作端基封尾。選擇 ODS 色譜柱時(shí)，請(qǐng)選擇進(jìn)行端基封尾的柱子。下述作為參考，反相色譜柱的一些相互作用。

相互作用的類型：

◆疏水性相互作用

疏水性高的物質(zhì)之間會(huì)有相互牽引作用，與相似相溶道理一樣，填料結(jié)合基團(tuán)的碳鏈（烷基鏈）越長(zhǎng)疏水性越高。

◆離子性相互作用

在反相分析中，弱酸性的硅醇基能與堿性化合物結(jié)合，與酸性化合物會(huì)發(fā)生排斥，會(huì)對(duì)峰型及保留時(shí)間有影響。更適合使用端基封尾處理的柱子或者調(diào)節(jié)溶劑的 PH 值，抑制這種作用。

◆氫鍵

氫原子易與電負(fù)性高的原子發(fā)生結(jié)合，如與氧、氮、硫、鹵素以及芳香環(huán)的 π 電子等作用。

◆π 電子相互作用

像苯環(huán)這類具有 π 電子結(jié)構(gòu)的化合物，相互之間會(huì)有電子吸引作用。像苯基柱這類具 π 電子作用的柱子，對(duì)于目標(biāo)物的 π 電子具有選擇性，通過此相互作用起到分離效果。

◆金屬配位吸附

填充劑硅膠基質(zhì)內(nèi)會(huì)含有部分殘留的金屬，故易會(huì)引起配位化合物的吸附現(xiàn)象。而且，解離的硅醇基與金屬離子一旦發(fā)生配位，會(huì)發(fā)生峰拖尾或者目的成分不能被洗脫的狀況。

選擇方法七：色譜柱接頭形式

HPLC 色譜柱的接頭根據(jù)廠家的不同也會(huì)有不同。一般分析色譜柱是 1/16 英寸外徑的管子使用螺絲進(jìn)行連接，若連接不同的接口，較易產(chǎn)生死體積與漏液現(xiàn)象。

特別對(duì)于不銹鋼的配管等，需用套圈固定管子，就必須選擇對(duì)應(yīng)的接口形式。

接口形式和螺距有英寸螺距和毫米螺距兩種。一般 Waters 接口型使用比較普遍。無論是 HPLC 或 UHPLC，通過選擇適當(dāng)?shù)纳V柱接口形式，InertSustain 以及 Inertsil 的性能能夠充分的發(fā)揮（標(biāo)準(zhǔn)接口為 Waters 接口型）。

選擇方法八：經(jīng)常使用的色譜柱規(guī)格

◆HPLC 分析

5μm, 150×4.6mm I.D.

5μm, 250×4.6mm I.D.

◆UHPLC, LC/MS 分析

2μm, 50×2.1mm I.D.

2μm, 100×2.1mm I.D.

3μm, 75×2.1mm I.D.

◆LC/MS 分析

3μm, 100×2.1mm I.D.

3μm, 150×2.1mm I.D.

5μm, 150×2.1mm I.D